Desarrollo de biosensores fluorescentes de la proteína calmodulina (CaM) como herramientas de investigación bioquímica
Estos estudios se han centrado en el desarrollo de biosensores fluorescentes de la proteína calmodulina (CaM) como herramientas de investigación bioquímica para el estudio de las interacciones proteína-proteína, proteína-péptido y en la búsqueda de nuevas entidades moleculares con propiedades bioactivas. De manera complementaria se realizan estudios de modelaje molecular (dinámica molecular, acoplamiento molecular “docking”, relación estructura actividad, etc.) para tratar de explicar a través de modelos estructurales las interacciones de estos sistemas con sus ligandos.
Proteína calmodulina (CaM)
La proteína CaM es una proteína intracelular, ubicua, altamente conservada en células eucariotas; posee dos dominios de unión al ion Ca+2 conectados por un segmento flexible, esta proteína presenta cambios conformacionales apreciables al unir diferentes ligandos. La unión del ion Ca+2 expone un par de parches hidrofóbicos en la proteína, los cuales hacen posible la unión y modulación con alrededor de 300 proteínas de interés farmacológico. Algunos ejemplos de estas proteínas incluyen la fosfodiesterasa 1 (PDE1), la adenilato ciclasa (AC), cinasa de cadena ligera de miosina (MLCK), calcineirina, oxido nitrico sintetasa endotelial (eNOS), caldesmon, sprectrina, neurogranin (NRGN), dominio matrix (MA), canales iónicos, la rianodina, los receptores IP3, etc. Estos complejos juegan papeles importantes en diversos procesos celulares tales como: transcripción genética, apoptosis, homeostasis metabólica, fosforilación y desfosforilación proteica, síntesis de proteínas, división celular, contracción del musculo liso, tubulación, regulación de canales iónicos, proliferación celular y quimiotaxis entre las más importantes. De igual forma la CaM une varios antagonistas clásicos tales como trifluoroperazina, clorpromacina, malbrancheamidas, xantonas, etc. [17-19]; los cuales son utilizados en la terapéutica de algunas patologías.
A la izquierda libre de ligandos (Apo-CaM, 1CFD.pdb), en el centro unida a cuatro iones de calcio (Ca+2-CaM 1CLL.pdb) y a la derecha unida al inhibidor trifluoperazina 2TFP-CaM (1A29.pdb)
Clasificación de blancos moleculares de la proteína CaM de acuerdo al proceso celular regulado.
Biosensores
Los biosensores son sistemas que presentan un mecanismo híbrido para transformar la información de las interacciones químicas en señales analizables por medio de mecanismos bioquímicos. Estos sistemas están constituidos por un sistema receptor que generalmente es un componente biológico (proteínas, canales iónicos, células, etc.) que interacciona específicamente con un analito y transduce la señal a un sistema detector, siendo este último de tipo espectroscópico, eléctrico, mecánico, etc. El interés en el desarrollo de biosensores ha sido particularmente impulsado por las necesidades de contar con nuevas y mejores herramientas para caracterizar las interacciones que presentan algunas proteínas de interés, así como desarrollar a futuro técnicas analíticas rutinarias y accesibles para el análisis de un gran número de muestras, con selectividad, alta sensibilidad y reproducibilidad.
Construcción de biosensores fluorescentes de la proteína CaM
La estrategia de construcción de estos biosensores consta de tres etapas básicamente (Figura 2). I) Un diseño racional de la posición donde se va a marcar de manera específica a la proteína en cuestión, utilizando herramientas computacionales tales como visualizadores moleculares, datos del aérea accesible a superficie e información de regiones de interacción, etc. II) Mutagénesis sitio-dirigida en la cual reemplazamos un aminoácido en particular por un residuo de cisteína y con el grupo tiol altamente reactivo. III) un marcaje sito-específico con compuestos reactivos a los tioles de las cisteínas.
Estrategia general en la construcción de biosensores, usando diseño racional, mutagénesis sitio-dirigida y marcaje sitio-específico